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    甲亢患者肠道微生态的特征-甲亢

    甲亢患者肠道微生态的特征-甲亢

    * 来源: 宋影春 李丹2 吕中伟 * 作者: admin * 发表时间: 2021-02-23 11:36:30 * 浏览: 1
    【摘要】目的探讨甲亢患者肠道菌群的特征。方法﹐以15例甲亢患者作为甲亢组,15例健康志愿者作为对照组。采用Ilumina Miseq高通量测序平台对甲亢组和对照组新鲜粪便样本中所有细菌的16S rRNA (16Sribosome RNA)-V3区进行DNA测序,分析操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)数量,分析肠道菌群物种的丰度,并进行聚类分析和代谢通路相关性分析。结果﹑样本稀疏曲线表明测序深度充分,物种多样性分析显示OTU值为24 578,微生物丰度较高,测序覆盖深度(Coverage 指数)>0.99。与对照组相比,在属水平,甲亢组肠道菌群的3个丰度指数(Ace,Sobs 和Chao)均低于对照组(P<0.05),2个多样性指数(Shannon 和Simpson)分别低于和高于对照组(P<0.05)。30份样品共检测到13个菌门,均以厚壁菌门,拟杆菌门,放线菌门和变形菌门占优势,差异无统计学意义。在属水平,共检测到246种菌群﹐对照组含有51种特有菌群,而甲亢患者肠道菌群种类显著减少,仅含有7种特有肠道菌群。甲亢组的直肠真杆菌属丰度明显低于对照组(P<0.05),ROC曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.72。在同与免疫有关的功能代谢的相关性分析中,发现直肠真杆菌属与上皮细胞的细菌侵入这一代谢通路呈负相关(r=—0.367,P=0.046)。结论﹐甲亢患者肠道菌群的丰度和多样性下降,直肠真杆菌属是甲亢患者区别于健康人的明显差异菌,直肠真杆菌属丰度的降低可能与甲亢免疫机制相关。菌群的定量分析可能早期预测甲亢。
    肠道菌群的数量众多,以至于被人们称为人类第二大基因库,其分布、产物及功能代谢通过调节宿主的营养吸收、生化指标甚至免疫系统而对宿主产生深远的影响[,故被当做一个潜在的机体内环境的影响因子,成为近年来全世界研究的热点。肠-脑轴、肠-肺轴等系统性联系的建立证明了肠道菌群可以作用于全身各大系统,包括免疫系统[2~1"]。肠道菌群调节机体自身免疫性疾病状态的作用,在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病以及炎症性肠病的研究中均有证实["- 13]。
    众所周知,甲亢作为一种自身免疫性疾病,是由调节性T细胞(regulatory T cell. Treg)功能降低或数量减少所引起,导致T淋巴细胞致敏,使B淋巴细胞产生甲状腺自身和相关受体抗体,刺激甲状腺异常合成和分泌过量的甲状腺激素到人体内环境,通过体液作用于人体各组织器官,造成机体代谢亢进和交感神经兴奋,引起多种器官功能的异常与损伤。甲亢的病因除了与基因易感性及碘摄入过多、药物等外环境相关之外,更受患者内环境如免疫细胞及其因子和自身抗体的异常等因素影响[ 14]。有文献报道肠道菌群可以通过其组成和分布的变化及其代谢产物影响免疫细胞和细胞因子,从而调节甲状腺的免疫状态1'5。另外,甲状腺由原始消化管的前肠部分分化而来,提供了肠道菌群微生态失衡关联相似同源结构的可能病理结构基础。说明肠道菌群可以作为一个内环境的影响因子,在甲亢的发病机制以及病程中有着不可小觑的作用。
    虽然国内外有关肠道菌群和甲状腺的研究较多,但大部分是研究肠道菌群与自身免疫性甲状腺疾病autoimmune thyroid disease, AITD),特别是桥本氏甲状腺炎( Hashimoto's thyroiditis)之 间的
    关系。少数有关甲亢与肠道菌群的研究只局限于甲亢患者的肠道菌群中数个菌种的丰度变化,并没有
    更深层次的研究[13]。本文观察甲亢患者肠道菌群的变化,并对变化的肠道菌群与甲亢患者的临床因
    子及甲亢相关的代谢功能进行相关性分析,可能为该病的发病机制提供进一步佐证,并可为治疗策略
    的制定及预后评估提供参考。
    资料和方法
    研究设计本研究旨在采集甲亢患者的粪便样本,采用Illumina高通量测序技术分析甲亢患者肠道菌群物种丰度、多样性和构成的变化趋势,通过成组设计探讨甲亢患者与健康人肠道菌群组成、功能和代谢通路上的差异,以期找出可用于判断甲亢患
    者的标记微生物。
    样本来源经同济大学附属第十人 民医院伦理委员会同意,患者及家属、志愿者签署知情同意书,收集本院2017年1月至6月15例首次人住核医学科病房的甲亢患者(男性1例,女性14例,年龄18~53岁,中位年龄35岁)作为甲亢(hyperthy-roidism, HT)组,同时收集15例健康志愿者(男性4例,女性11例,年齡22~43岁,中位年龄25岁)作为对照(healthy control, HC)组。所有患者均按照《甲状腺机能亢进和其他甲状腺中毒原因诊断和管
    理指南y[16]初次诊断为甲亢。所有志愿者的病史查阅结果显示,检测当年及以往每年的健康体检均没有内分泌系统以及甲状腺激素的异常结果,故认为可以排除对照组内分泌系统的疾病。所有受试者均排除肠道疾病,取样前1个月内未服用抗生素、益生菌等。
    样本采集在无菌条件 下获取研究对象自然排出的新鲜粪便,用无菌棉签避开表面,挑取中心部分粪便,约黄豆粒大小,放人无菌冻存管后立即速冻,采样程序符合医院伦理要求。粪便样本送至实验室提取DNA.余粪便样本- 80 T保存备用。DNA抽提和PCR扩增根据E. Z. N. Asoil试剂盒(美国Omega Bio-tek 公司)说明书进行总DNA抽提,DNA纯度和浓度利用Nanodrop2000进行检测,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量:用338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-G-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTA-AT-3')引物对V3-V4可变区进行PCR扩增,扩增程序为95 C预变性5 min,27个循环(95 C变性30 s,55 C退火30s,72 C延伸30 s),最后72 C延伸10 min,10 C保持(PCR仪: ABI GeneAmp9700型)。扩增体系为20 μL.4 pL 5X FastPfu缓冲液.2 μL 2.5 mmol dNTPs,各0.8 μL的引物(5 pumol),0.4 μ山FastPfu 聚合酶.0.2 μL BSA以及10ngDNA模板,补ddH2O至20μL。
    lumina Miseq测序使用2%的琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Extraction Kit(美国Axygen Biosiences 公司)进行缆化, Tris-HCl冼脱,2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorM- ST(美国Promega公司)进行检测定量。根据IluminaMiseq平台(美国llumnina Sandiego公司)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建双端( paired-end, .PE)侧序的文库。利用Illumina 公司的MiseqPE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限.公司)。原始数据上传至NCBI数据库中。数据处理Miseq 测序得到的PE reads首先根据overlap的关系进行拼接,同时对序列质量进.行质控和过滤,区分样本后,使用UPARSE软件(version 7. 1 http://drive5. com/uparse/), 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类;使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDPcassifier(htp://rdp. cme. msu, edu/)对每条序列进行物种分类注释,对比Silva数据库(Silva 128),设置比对阈值为70%。将甲亢组和对照组的数据分成两组,基于OUT进行a.β多样性指数分析,基于OUT聚类分析结果.对OUT进行a、β多样性指数分析,并检测测序深度;基于分类学信息,在OUT、门、属等.各个分类水平上进行群落结构的统计学分析。在上述分析的基础上,对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等-系列深入的统计学和可视化分析,包括肠道菌群之间以及两组之间的差异菌与患者的临床因子之间的相关性.分析。
    宏基因组分析通 过PICRUSt (PhylogeneticInvestagation of Communities by Reconstruction ofUnobserved States)平台对15例HT样品的OTU丰度表进行标准化,即去除16S marker gene 在物
    种基因组中的拷贝数目的影响;然后将15例HT样品区别于正常人的差异菌测序数据输人KEGG(Kyoto Encyelopedia of Genes and Genomes)数据库进行比对,根据KEGG数据库的信息,获得代谢通路信息并进行分析,并根据OTU丰度计算各功能类别的丰度以及差异菌,与筛选出的代谢通路进行相关性分析。
    统计学处理采用R 语言包(V.3.4.3)对数据进行处理,用Mann- Whitney U检验进行两组间基本特征的差异分析,用成组资料的t检验进行两组指数间及物种间差异分析.应用Spearman 秩检验进行相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。
    结果
    一般情况我们共招募 15例甲亢患者和15个健康志愿者,通过问卷调查发现,甲亢组和对照组的年龄、性别、饮食及生活习惯差异无统计学意义,具体见表1。
    样本分析甲亢患者 的粪便样本全部收集于本次人院后服用1"1之前。将15例甲亢患者及15例健康对照分别纳人HT组和HC组。HT组的甲亢相关临床指标见表2,HC组检测当年及以往每年的健康体检结果显示没有甲状腺激素异常,认为可以排除甲状腺疾病,且实验同时间段未重复进行甲状腺激素检测,故未给出健康对照的甲状腺检测结果。
    样本稀释曲线用来比较测序数据量不同的研究样本的物种数目及丰富度。本研究样本的稀释曲线见图1A、B,随着样本读数的增加,在序列数低于5 000时,样本稀释指数随序列数增加而迅速增加,在序列数大于10000时,稀释曲线逐渐趋于平缓,说明测序数据量足够大,数据量合理,可以反映样本中绝大多数肠道菌群的物种信息,能够进行后续分析。在属的水平上进行相似性分析(analysis ofsimilarities , ANOSIM)以及Adonis分析,即非参数多因素方差分析,可知两组的组间差异是高于各自的组内个体差异的(t= 3.67,P=0.001),所以可以对数据进行组间差异分析(图2)。
    肠道菌群丰度及多样性分析通过16s rRNA-V3区的深度测序,在属水平,HT组中反映物种丰富度的指数均低于HC组,其中包括sobs指数(t=2.75,P=0, 010),25) ,ace指数(t= 2.67,P=0.015,37)、chao指数(t= 2.99,P=0.007,101);两组反映肠道菌群物种丰富度和均一性的指数相比,HT组
    的shannon指数(t= 2.64,P= 0.0)1,472)、coverage指数(t=2.71,P=).016,72)低于HC组,而simpson指数(t= 2.37,P=0.022,58)高于HC组,这些差异均具有统计学意义(图1D),反映了HT组
    为了观察肠道菌群的直观变化,我们对这两组.的肠道菌群进行物种组成分析。Venn图显示30份样品共检测到13个菌门(图3C),均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门( Bucteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门( Proteobacteria)占优势。虽然两组总的微生物组成差异无统计学意义
    但是在门水平,通过直观观察Venn 图显示,HT组的变形菌门和拟杆菌门的比例较HC组有所,上升,而放线菌门与厚壁菌门相对下降(图3A)。在属水平,Venn图显示共检测到246种菌群,两组共有188种菌群,对照组含有51种特有菌群,而甲亢肠道菌群种类显著减少,仅含有7种特有肠道菌图(图3D)。其中,通过直观观察,HT组的直肠真杆菌( Eubacterium rectale group) 与双歧杆菌( Bifidobacterium)在总的物种组成中所占丰度的
    比例均少于HC组,而拟杆菌(Bacteroides)、柔嫩梭菌( Faecalibacterium)与大肠杆菌志贺菌(Escherichia Shigella)的比例升高(图3B)。HT组直肠真杆菌的丰度低于HC组(1 = 2.11,P=0.044) ,差异具有统计学意义(图4A),而HT组双歧杆菌的丰度较HC组低,HT组肠道内的优势菌群拟杆菌.柔嫩梭菌以及大肠杆菌志贺菌的丰度高于HC组,这些差异均在两倍以。上,但可能因为组内的个体差异或样本量的关系,导致结果差异无统计学意义。
    差异菌功能分析HT 组直肠真杆菌的丰度显著低于HC组,经过随机森林分析,所得到的ROC曲线的AUC为0. 72(图4B) ,说明直肠真杆菌可以用来区分正常人和甲亢患者。探索直肠真杆菌与HT患者的临床因子之间的关联性,甲亢相关临床因子包括年龄、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺原氨酸(TT3)、甲状腺素(TT4)、促甲状腺素(TSH)、TSH受体抗体甲亢作为- -种器官特异性自身免疫病,是由调
    节性T细胞(regulatory T cell, Treg)功能降低或数量减少,导致T淋巴细胞致敏,使B淋巴细胞产生甲状腺自身和相关受体抗体引起。甲亢患者体内存在针对甲状腺自身抗原的致敏性T淋巴细胞,被植物血凝素phytohaemagglutinin,PHA)激活后可产生大量的类似于促甲状腺激素(thyroid stimulatinghormone,TSH)的长效甲状腺刺激素(long actingthyroid stimulator,LATS),LATS作为一种针对甲状腺的抗体,可激活甲状腺滤泡上皮细胞分泌甲状腺激素而引起甲亢;PHA激活T淋巴细胞以后再刺激B淋巴细胞,致其产生大量的TSH受体抗体( thyroid stimulating hormone receptor antibody ,TRAB),与TSH受休相结合,进一步激活cAMP,
    兴奋甲状腺分泌甲状腺激素从而引起甲亢[7]。在现有的调查中,60%~90)%的甲亢患者LATS增高,90%的患者TRAB为阳性。这些都证明了免疫细胞和细胞因子可以作为调节免疫机制的微环境来作用于甲状腺。
    近年来的研究已确定肠道菌群参与免疫细胞表.观遗传基因组的重塑机制,凸显了肠道菌群以及肠道微生物来源的信号对宿主免疫机制的环境作用。在这个过程中,表观遗传机制受循环与环境的影响,决定了T淋巴细胞的分化与功能,促成了多种慢性病的全身效应,例如哮喘、炎症性肠病和糖尿病等[18],对于这些具有很多复杂病因的慢性疾病,肠道菌群在其发生发展中的作用不可小觑。微生物及其代谢产物通过激活肠壁细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors, TLR),使其释放参与炎症过程的TNF-8,II-1或IL-6以及抗炎细胞因子IL-10),此,外还释放决定T淋巴细胞表型的细胞因子IL-17和IL-23。初始CD4 + T细胞由TNF-B、 IL-1、IL-
    23[1]等细胞因子和微生物及其代谢产物诱导分化为Tregs,Tregs可以通过调节树突细胞对效应细胞的抑制作用,分泌IL-10、JIL-35 和TGF-β等细胞因子,诱导靶细胞溶解来维持机体对自身抗原的耐受性并防止炎症和过敏反应[21]。近年来国内外的研.究证明了多种肠道细菌的代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),尤其是丁酸盐.

    [ Abstract]
    ObjectiveTo investigate the characteristics of gut microbiota in patients with hyperthyroidism. Methods Fifteen patients with byperthyroidism were served as study group, and 15 healthy volunteers were served as control group. The Illumina Miseq high- throughput sequencing
    platform was used to analyze DNA sequencing of the 16S rRNA-V3 region of all bacteria in the freshfaecal samples from the patients and controls , the number of operational taxonomic units (OTUs) and the abundance of gut microbiota species were analyzed, Cluster analysis and meta bolic pathway correlation analysis were also conducted.
    Results
    The sample rarefaction curve showed that the sequencing depth was sufficient , and species diversity analysis showed that the OTU value was 24 578.
    The microbial abundance was high , and the Coverage index >0. 99. The three abundance indexes (Ace,
    Sobs,and Chao) of the gut microbiota in the hyperthyroidism group were lower than those in the
    control group (P<0. 05). And the two diversity indices ( Shannon and Simpson) were lower and higher
    than the control group respectively (P<0. 05). A total of 13 phyla were detected in 30 samples,all of
    which were dominated by Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria and Proteobacteria , the difference
    was not statistically significant. At the genus level,a total of 246 species of bacteria were detected. The
    control group contained 51 species of endemic bacteria , while the gut microbiota species of the patients
    had a significant decrease, with only 7 specific species. The abundance of gut microbiota in the
    hyperthyroidism group was significantly lower than that in the control group (P<0.05) ,and the AUC 
    of ROC was 0.72. In the correlation analysis with immunologically related functional metabolism,it was
    found that Eubacterium rectale group was negatively correlated with the meta bolic pathway of bacterial
    invasion of epithelial cells (r= - 0.367,P= 0.046). Conclusions The abundance and diversity of
    gut microbiota in patients with hyperthyroidism are decreased. Eubacterium rectale group can
    significantly distinguish the patients with hyperthyroidism from healthy people. The decrease in the
    abundance of Eubacterium rectale group may be related to the immune mechanism of hyperthyroidism.
    Quantitative analysis of the bacteria is possible to predict hyperthyroidism at early stage.